GST-Pull down实验原理及FAQ
文章目录:
一、GST-Pull down实验原理及FAQ
GST-Pull down实验原理与常见问题解答
GST-Pull down实验的核心原理是利用DNA重组技术,将目标蛋白与GST(谷胱甘肽S转移酶)融合,形成融合蛋白,固定在带有GSH的琼脂糖珠上。当存在目标蛋白的配体时,它们会通过亲和力与GST融合蛋白结合,从而实现目标蛋白的“拉下”分离。这种方法常用于检测蛋白质间的相互作用。
实验中遇到的常见问题和解决策略包括:
- 假阳性结果: DNA结合蛋白间的非特异性相互作用可能导致假阳性。加入核酸酶可有效减少这类干扰。
- 影响因素: 选择高效的表达载体(如pGEX-4T-1),控制诱导温度(16℃~25℃),以及确保诱导时间的适宜,都是提高实验结果的关键。
- 胶带条纹差异: 检查样本处理的准确性,如制胶过程中的均匀性和无菌操作,是解决条纹不一致的关键。
- 蛋白降解: 通过添加蛋白酶抑制剂和低温操作,可以减少蛋白降解对实验的影响。
卡梅德生物提供稳定细胞系筛选、抗体工程、蛋白和噬菌体展示等全面技术支持,我们研发的重组蛋白和试剂旨在满足科学研究和药物发现的需要,为您的实验提供专业的解决方案。
二、GST pull-down 技术原理及实验流程——钟鼎生物
GST-Pull Down 作为体外检测蛋白间直接互做的行之有效的方法,可用于证实预测的蛋白质-蛋白质相互作用的存在,也可用作未知的蛋白质-蛋白质相互作用的初始筛选测定法。(服务请咨询)
GST-Pull Down的原理
GST Pull-Down实验基于GST(glutathione-S-transferase),即谷胱甘肽-S-转移酶蛋白,可以与谷胱甘肽(Glutathione,GSH)结合。将GSH固定于琼脂糖珠上,形成GSH-琼脂糖珠,将已知蛋白X与GST融合表达,获得的GST-X可与GSH-琼脂糖珠结合,若环境中存在与X蛋白互做的蛋白Y,则会形成“琼脂糖珠-GSH-GST-X-Y”复合物,与X蛋白互做的蛋白即可被分离并检测。
GST Pull-Down实验方法
(基于钟鼎实验案例,验证预测的两个蛋白的互做)
实验设计
表1 Pull Down实验体系
编号 1 2 3 4
A-GST+--+
B-His-+-+
GST--+-
实验设计
1.IPTG诱导pET28a-B-His及pGEX-4T-1-A载体融合蛋白表达
1.1 表达载体转化至大肠杆菌Rosseta;
1.2 挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/mL Amp的3 mL LB培养液的试管中,37℃摇菌过夜,制备种子液;
1.3 次日按1:100接种于50 μg/mL Amp的30 mL LB培养液中,37℃摇至菌体OD600为0.8;
1.4 向菌液中加入IPTG至终浓度为0.5 mM,11~28℃摇床培养,诱导融合蛋白表达4~8h;
1.5 将菌液离心弃上清,用 PBS重悬菌体沉淀,超声波破碎,离心取上清;
1.6 吸取少量上清用于SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。
2.细胞破碎及蛋白纯化
采用超声破碎,GST柱亲和纯化及Ni柱亲和纯化,分别获得纯化后的目的蛋白。
2.1 GST柱纯化
(1)利用低压层析系统,细胞裂解上清液上样至GST Binding-Buffer预平衡的GST亲和层析柱;
(2)用GST Binding-Buffer冲洗层析柱,至流出液OD280值到达基线;
(3)用GST Elution-Buffer洗脱目的蛋白,收集流出液;
(4)收集的蛋白溶液加入透析袋中,使用Tris-HCl透析过夜;
(5)进行SDS-PAGE分析和WB分析。
2.2 Ni柱纯化
(1)利用低压层析系统,细胞裂解上清液上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose Cl-6B亲和层析柱;
(2)用Ni-IDA Binding-Buffer冲洗层析柱,至流出液OD280值到达基线;
(3)用Ni-IDA Washing-Buffer冲洗层析柱,至流出液OD280值到达基线;
(4)用Ni-IDA ELution-Buffer洗脱目的蛋白,收集流出液;
(5)收集的蛋白溶液加入透析袋中,使用Tris-HCl进行透析过夜;
(6)进行SDS-PAGE分析和WB分析。
3.GST-Pull Down实验
使用GST Protein Interaction Pull-Down Kit (购自Thermo公司)
3.1平衡树脂(GST)
(1)混匀Immobilized Glutathione,彻底重悬树脂;
(2)各取100 µL 50% 树脂悬浮液到4个离心管中,1250 ×g离心2 min弃上清;
(3)用500 µl PBS重悬树脂,1250 ×g离心2 min移除上清,重复3次。
3.2蛋白互作
(1)按照按照表1分别将A-GST蛋白和B-His蛋白加入到谷胱甘肽树脂中,将混合物在4°C旋转混匀孵育过夜;
(2)1250 ×g离心5 min后,弃上清(上清要取净);
(3)用500 µL PBS重悬树脂。1250×g 离心2 min弃上清。重复3次。
3.3诱饵蛋白和靶蛋白复合物的洗脱
(1)每管加入50 µL Elution Buffer;
(2)4°C 旋转混匀孵育20 min;
(3)1250 ×g 离心2 min弃上清,离心下来的液体置于冰上;
(4)取20 µL样品进行SDS-PAGE和WB检测。
钟鼎生物官网
到此,以上就是小编对于gst pull down的问题就介绍到这了,希望介绍关于gst pull down的2点解答对大家有用。
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